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信号弱或无信号
1可能的原因抗体灵敏度和反应性
建议请查看抗体网页的“灵敏度/特异性”部分。敏感性仅为转染性或重组蛋白的抗体不足以检测靶标的内源性水平。内源性灵敏度抗体适用于所有样品类型（内源性、转染或重组蛋白）。另外，可能需要增加或减少抗体用量，以获得最适信号，具体取决于样品中的靶蛋白丰度。我们建议以产品网页和说明书上显示的稀释比作为优化的起点。
另一个需要考虑的因素是抗体的物种反应性。CST 已对产品网页“反应性”部分列出的物种进行了内部验证。如果您的目的物种未列出，请联系我们的技术支持团队，他们将非常乐于帮助您确定抗体与您模型物种的蛋白序列的预期反应性。
2可能的原因磷酸化或修饰蛋白的水平低
建议在未处理的细胞系或组织中，许多翻译后修饰蛋白的基底表达水平较低。我们建议使用 PhosphoSitePlus 查找与您特定修饰位点有关的使用低通量方法的文献，或使用我们靶标阳性对照处理表查找处理方法以及可作为阳性对照的细胞系或组织。
在细胞提取物中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂，对于避免蛋白降解和维持蛋白得率至关重要。应将焦磷酸钠（最终浓度为 2.5 mM）和 β-甘油磷酸盐（最终浓度为 1.0mM）作为丝氨酸/苏氨酸磷酸酶抑制剂加入裂解缓冲液中。应加入正钒酸钠（最终浓度为 2.5 mM）以抑制酪氨酸磷酸酶。还可以使用 Protease Inhibitor Cocktail (100X) (#5871) 或 Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) (#5872)。
举例：通过处理诱导磷酸化： 使用 Phospho-IKKα/Β (Ser176/180) (16A6) Rabbit mAb 对用 TPA（#9905，80 nM，24 小时）进行分化，并用 1 μg/mL LPS 处理所示时间的 THP-1 细胞的提取物进行蛋白印迹分析。磷酸化 IKKa/b 等某些靶标需要特定的处理条件才能达到最适表达水平。
3可能的原因组织或细胞系中的蛋白表达水平低
建议我们建议使用 BioGPS 或 Human Protein Atlas 等表达谱分析工具以及科学文献，来查找细胞或动物组织是否预期能够充分表达目的靶蛋白。我们始终建议设置已知的阳性对照，以判断实验结果。如需了解我们许多抗体的推荐对照信息，请参阅我们靶标的阳性对照处理表。
对于全细胞提取物，每个泳道建议上样至少 20-30 ug 的蛋白，以便检测全组织提取物中的靶标总量/未修饰靶标量。然而，通常需要将总蛋白上样量增加到每个泳道至少 100ug，以检测全组织提取物中的修饰靶标（如磷酸化和剪切靶标）。当组织中只有一小部分细胞含有翻译后修饰靶标时，全组织提取物可能需要上样更多蛋白。在细胞提取物中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂，对于避免蛋白降解和维持蛋白得率至关重要。我们建议往裂解缓冲液中加入亮抑酶肽（最终浓度为1.0ug/mL）和 PMSF (#8553) 作为蛋白酶抑制剂。还可以使用 Protease Inhibitor Cocktail (100X) (#5871) 或 Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) (#5872)。
4可能的原因重复使用预稀释的抗体
建议不建议重复使用稀释的抗体，因为稀释后的抗体稳定性较差，并且存放太久的稀释缓冲液容易产生微生物或真菌污染。我们建议始终使用新鲜稀释的抗体，以获得最适结果。
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拖尾效应
1可能的原因重复使用预稀释的抗体
建议不建议重复使用稀释的抗体，因为稀释后的抗体稳定性较差，并且存放太久的稀释缓冲液容易产生微生物或真菌污染。我们建议始终使用新鲜稀释的抗体，以获得最适结果。
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散斑或斑点样印迹
1可能的原因组织或细胞系中的蛋白表达水平低
建议我们建议使用 BioGPS 或 Human Protein Atlas 等表达谱分析工具以及科学文献，来查找细胞或动物组织是否预期能够充分表达目的靶蛋白。我们始终建议设置已知的阳性对照，以判断实验结果。如需了解我们许多抗体的推荐对照信息，请参阅我们靶标的阳性对照处理表。
对于全细胞提取物，每个泳道建议上样至少 20-30 ug 的蛋白，以便检测全组织提取物中的靶标总量/未修饰靶标量。然而，通常需要将总蛋白上样量增加到每个泳道至少 100ug，以检测全组织提取物中的修饰靶标（如磷酸化和剪切靶标）。当组织中只有一小部分细胞含有翻译后修饰靶标时，全组织提取物可能需要上样更多蛋白。在细胞提取物中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂，对于避免蛋白降解和维持蛋白得率至关重要。我们建议往裂解缓冲液中加入亮抑酶肽（最终浓度为1.0ug/mL）和 PMSF (#8553) 作为蛋白酶抑制剂。还可以使用 Protease Inhibitor Cocktail (100X) (#5871) 或 Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) (#5872)。
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多个条带或非特异性结合
1可能的原因磷酸化或修饰蛋白的水平低
建议在未处理的细胞系或组织中，许多翻译后修饰蛋白的基底表达水平较低。我们建议使用 PhosphoSitePlus 查找与您特定修饰位点有关的使用低通量方法的文献，或使用我们靶标阳性对照处理表查找处理方法以及可作为阳性对照的细胞系或组织。
在细胞提取物中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂，对于避免蛋白降解和维持蛋白得率至关重要。应将焦磷酸钠（最终浓度为 2.5 mM）和 β-甘油磷酸盐（最终浓度为 1.0mM）作为丝氨酸/苏氨酸磷酸酶抑制剂加入裂解缓冲液中。应加入正钒酸钠（最终浓度为 2.5 mM）以抑制酪氨酸磷酸酶。还可以使用 Protease Inhibitor Cocktail (100X) (#5871) 或 Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) (#5872)。
举例：通过处理诱导磷酸化： 使用 Phospho-IKKα/Β (Ser176/180) (16A6) Rabbit mAb 对用 TPA（#9905，80 nM，24 小时）进行分化，并用 1 μg/mL LPS 处理所示时间的 THP-1 细胞的提取物进行蛋白印迹分析。磷酸化 IKKa/b 等某些靶标需要特定的处理条件才能达到最适表达水平。
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深色或黑色印迹
1可能的原因抗体灵敏度和反应性
建议请查看抗体网页的“灵敏度/特异性”部分。敏感性仅为转染性或重组蛋白的抗体不足以检测靶标的内源性水平。内源性灵敏度抗体适用于所有样品类型（内源性、转染或重组蛋白）。另外，可能需要增加或减少抗体用量，以获得最适信号，具体取决于样品中的靶蛋白丰度。我们建议以产品网页和说明书上显示的稀释比作为优化的起点。
另一个需要考虑的因素是抗体的物种反应性。CST 已对产品网页“反应性”部分列出的物种进行了内部验证。如果您的目的物种未列出，请联系我们的技术支持团队，他们将非常乐于帮助您确定抗体与您模型物种的蛋白序列的预期反应性。
