多个条带或非特异性结合
磷酸化或修饰蛋白的水平低
在未处理的细胞系或组织中，许多翻译后修饰蛋白的基底表达水平较低。我们建议使用 PhosphoSitePlus 查找与您特定修饰位点有关的使用低通量方法的文献，或使用我们靶标阳性对照处理表查找处理方法以及可作为阳性对照的细胞系或组织。
在细胞提取物中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂，对于避免蛋白降解和维持蛋白得率至关重要。应将焦磷酸钠（最终浓度为 2.5 mM）和 β-甘油磷酸盐（最终浓度为 1.0mM）作为丝氨酸/苏氨酸磷酸酶抑制剂加入裂解缓冲液中。应加入正钒酸钠（最终浓度为 2.5 mM）以抑制酪氨酸磷酸酶。还可以使用 Protease Inhibitor Cocktail (100X) (#5871) 或 Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) (#5872)。
举例：通过处理诱导磷酸化： 使用 Phospho-IKKα/Β (Ser176/180) (16A6) Rabbit mAb 对用 TPA（#9905，80 nM，24 小时）进行分化，并用 1 μg/mL LPS 处理所示时间的 THP-1 细胞的提取物进行蛋白印迹分析。磷酸化 IKKa/b 等某些靶标需要特定的处理条件才能达到最适表达水平。
